De genomiske sekvensene til de fleste virus har vært kjent.Nukleinsyreprober som er korte DNA-segmenter designet for å hybridisere med komplementære virale DNA- eller RNA-segmenter.Polymerasekjedereaksjonen (PCR) er en mer effektiv teknikk for virusdeteksjon.Diagnostiske metoder med høy gjennomstrømning er nylig utviklet.
A. Nukleinsyrehybridiseringsteknikk
Nukleinsyrehybridisering, hovedsakelig inkludert Southern blotting (Southern) og Northern blotting (Northern), er en ny teknikk i rask utvikling innen virusdiagnostikk.Begrunnelsen for hybridiseringsanalysen er å bruke korte segmenter av DNA (kalt "probe") designet for å hybridisere med komplementære virale DNA- eller RNA-segmenter.Ved oppvarming eller alkalisk behandling separeres dobbelttrådet mål-DNA eller RNA i enkelttråder og immobiliseres deretter på en fast bærer.Etter det tilsettes probe og hybridiseres med mål-DNA eller RNA.Ettersom proben er merket med isotop eller ikke-radioaktiv nuklid, kan mål-DNA eller RNA påvises gjennom autoradiografi eller av biotin-avidin-systemet.Siden de fleste virale genomer har blitt klonet og sekvensert, kan de påvises ved å bruke virusspesifikke sekvenser som prober i prøven.For tiden inkluderer hybridiseringsmetodene: dot blot, in situ hybridisering i celler, DNA blotting (DNA) (Southern blot) og RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B.PCR-teknologi
De siste årene har det blitt utviklet en serie in vitro nukleinsyreamplifikasjonsteknikker basert på PCR, for å teste ufølsomme eller ikke-dyrkbare virus.PCR er en metode som kan syntetisere spesifikk DNA-sekvens ved in vitro polymerasereaksjon.Prosessen med PCR inkluderer en termisk syklus på tre trinn: denaturering, annealing og forlengelse Ved høy temperatur (93℃~95℃) separeres det dobbelttrådete DNA i to enkelt-DNA-tråder;deretter ved lav temperatur (37℃~60℃), annealerer to syntetiserte nukleotidprimere til de komplementære DNA-segmentene;mens ved passende temperatur for Taq-enzym (72 ℃), starter syntese av nye DNA-kjeder fra primer 3'end ved bruk av komplementært DNA som maler og enkeltnukleotider som materialer.Så etter hver syklus kan en DNA-kjede amplifiseres til to kjeder.Ved å gjenta denne prosessen, kan hver DNA-kjede syntetisert i en syklus brukes som mal i neste syklus, og antall DNA-kjeder dobles i hver syklus, noe som betyr at produksjonen av PCR forsterkes i en 2n log-hastighet.Etter 25 til 30 sykluser identifiseres produksjonen av PCR gjennom elektroforese, og de spesifikke DNA-produktene kan observeres under UV-lys (254nm).For sin fordel med spesifisitet, sensitivitet og bekvemmelighet, har PCR blitt tatt i bruk i klinisk diagnose av mange virusinfeksjoner som HCV, HIV, CMV og HPV.Siden PCR er svært sensitiv, kan den oppdage virus-DNA på fg-nivå, bør operasjonen utføres svært nøye for å unngå falsk positiv.I tillegg betyr positivt resultat i nukleinsyretest ikke at det er levende smittsomt virus i prøven.
Med bred anvendelse av PCR-teknikk utvikles nye teknikker og metoder basert på PCR-teknikk for forskjellige testformål.For eksempel kan sanntids kvantitativ PCR oppdage viral belastning;in situ PCR brukes til å identifisere virusinfeksjon i vev eller celler;Den nestede PCR kan øke spesifisiteten til PCR.Blant dem har sanntids kvantitativ PCR blitt utviklet raskere.Mange nye teknikker, som TaqMan-hydrolyseprobe, hybridiseringsprobe og molekylær beacon-probe, har blitt kombinert til kvantitativ PCR-teknikk i sanntid, som er mye brukt i klinisk forskning.I tillegg til å identifisere virusmengden i pasientens kroppsvæske nøyaktig, kan denne metoden også brukes til å oppdage medikamenttolerante mutanter.Derfor brukes kvantitativ PCR i sanntid hovedsakelig i kurativ effektevaluering og overvåking av medikamenttoleranse.
C. Høygjennomstrømningsdeteksjon av virale nukleinsyrer
For å møte behovene for rask diagnostisering av nye nye smittsomme sykdommer, er det etablert ulike metoder for høy gjennomstrømning, som DNA-brikker (DNA).For DNA-brikker syntetiseres spesifikke prober og festes til små silisiumbrikker i svært høy tetthet for å danne DNA-probe-mikroarray (DNA) som kan hybridiseres med prøve.Hybridiseringssignalet kan avbildes med konfokalt mikroskop eller laserskanner og viderebehandles av datamaskinen og et stort datasett om forskjellige gener kan oppnås.Det finnes to typer DNA-brikker."Syntesebrikken" er som følger: de spesifikke oligonukleotidene syntetiseres direkte på brikkene.En annen er DNA pool chip.De klonede genene eller PCR-produktene er ordnet trykt på objektglasset.Fordelen med DNA-brikketeknologi er samtidig påvisning av en enorm mengde DNA-sekvenser.Den nyeste versjonen av patogendeteksjonsbrikken kan identifisere over 1700 menneskelige virus samtidig.DNA-brikketeknologi løste problemene med tradisjonelle nukleinsyrehybridiseringsmetoder og har svært brede anvendelser innen virusdiagnose og epidemiologiske studier.
Innleggstid: 23. desember 2020